La principal inquietud cuando ves un análisis químico o realizas una medida analítica es cómo estar seguro de que los valores obtenidos se corresponden a la concentración real en la muestra y si el margen de error obtenido es debido a la variabilidad intrínseca del material analizado o a la imprecisión de nuestro método de análisis. Por ejemplo, cuando analizamos los cannabinoides de una muestra de cannabis un valoración baja del THC puede suponer que esa muestra sea legal (si tenemos un valor por debajo del 0,2 %) o ilegal (si tenemos un valor por encima del 0,2 %) lo que puede suponer tener que destruir toda una cosecha. Por ello, que tenemos que tener un especial cuidado a la hora de realizar los análisis y diseñar métodos y procedimientos que nos permitan controlar cuanto nos desviamos de los valores reales.
Estos métodos se centran en varios aspectos: el control del muestreo, el control del tratamiento de muestra, el control del sistema de medida y la comparación entre resultados de distintos laboratorios de análisis entre ellos. En este artículo vamos a hablar sobre los mecanismos de control y supervisión que cada laboratorio debe tener y considerar para estar seguros de la calidad de sus resultados.
El primer concepto que hay que tener muy claro a la hora de hablar de calidad de un resultado analítico es la diferencia entre exactitud y precisión. Como exactitud nos referimos a lo cercano que es el valor obtenido de la cantidad real que hay en la muestra. La precisión, por otro lado, es la variación entre los datos obtenidos de varios análisis de una sola muestra. Esto es muy fácil de entender si visualizamos la concentración real como el centro de una diana y cada una de las medidas como un dardo que lanzamos contra dicha diana: en un análisis exacto los dardos estarán cercanos al centro de la diana mientras que en uno preciso estarán todos los dardos juntos en el centro, si es preciso y exacto, o en otra parte de la diana, si es un análisis preciso pero no exacto.
Ilustración 1: Diferencias entre exactitud y precisión
Tener un conocimiento de una magnitud tan importante como la precisión es una de las principales razones por las que siempre hay que entregar los resultados de un análisis con su correspondiente margen de error. Este margen de error, como ya contamos en el anterior artículo, corresponde por un lado a la variabilidad de la muestra pero también evalúa la precisión del laboratorio a la hora de realizar los análisis.
La precisión es un parámetro relativamente fácil de evaluar simplemente repitiendo los análisis. Esta es la razón por la que en un buen laboratorio siempre realizan cada análisis, al menos, por triplicado. Pero el estudio de la exactitud es harina de otro costal, para asegurar la exactitud de los análisis hay que tener un complejo sistema de calibrado, control y comparación que nos permita tener una imagen lo más clara posible de cuanto se alejan nuestros resultados de los valores verdaderos de concentración en la muestra.
El primer y principal instrumento para ajustar la exactitud de los análisis es la calibración.
La calibración consiste en la medida de una cantidad exacta y conocida del compuesto a analizar de tal manera que podamos relacionar la señal obtenida con la concentración de manera inequívoca, exacta y precisa.
Para realizar un calibrado necesitamos un material, o disolución, de concentración definida con total exactitud. Estas disoluciones son las llamadas disoluciones estándar, disoluciones patrón o simplemente patrones. Estas disoluciones se venden caracterizadas y con un certificado que te asegura la concentración que tienen, también indican claramente su margen de error, y te da una fecha de caducidad para ser empleados. Los patrones son de los consumibles de mayor precio de todo el proceso de análisis, pero la calidad de estas disoluciones determina la calidad de todo el trabajo que realicemos a partir de ellas y nunca debe repararse en gastos con ellas adquiriéndose siempre, si deseamos análisis precisos y de calidad, las ofrecidas por los mejores suministradores.
Ilustración 2: Ejemplo de certificado de un patrón de análisis
Ilustración 3: Ampolla con disolución patrón de propano de Emerald Scientific.
Hay tres tipos fundamentales de calibración que podemos realizar para poner a punto un equipo, cada una de ellas se utiliza en determinadas circunstancias.
· Calibrado por patrón externo: Este tipo de calibrado consiste en medir una o una serie de disoluciones estándar o patrones (con concentraciones conocidas) para obtener la sensibilidad del análisis al dividir la señal obtenida entre la concentración conocida directamente. Este tipo de calibrado es el más común y se utiliza para analizar compuestos en muestras con pocas sustancias que puedan interferir (con poca matriz de muestra o en medidas acopladas a métodos de separación eficaces). Es muy común en la cromatografía líquida, por ejemplo.
· Calibrado por patrón interno: En este tipo de calibración se añade, tanto a los patrones como a todas las muestras, un compuesto artificial de comportamiento similar a las sustancias a analizar y se mide la sensibilidad a partir de la división entre la señal del compuesto a analizar y la del patrón interno. Con este calibrado se compensan los efectos debidos a otras sustancias de la muestra (si afectan a la sustancia de interés también afectaran al patrón interno, por eso se elige una sustancia similar) y a la variabilidad propia del método. Este calibrado es muy común en la cromatografía de gases.
· Calibrado por adición estándar: En este tipo de calibrado lo que se hace es añadir una o una serie de cantidades de la sustancia a analizar sobre la muestra realizando, directamente, un calibrado por cada muestra analizada y obteniendo la concentración por retroceso. Este método de calibrado es el menos exacto pero es el empleado cuando las otras sustancias de la muestra son muy complejas y afectan de manera imprevisible a las señales lo que impide que se pueda comparar con patrones externos. Este calibrado es común, por ejemplo, en el análisis de metales pesados por espectroscopia atómica en cámara de grafito.
Ilustración 4: Diferentes tipos de calibrado.
Estos tipos de calibrados son los procedimientos básicos para asegurar la precisión (a través de la variabilidad entre medidas iguales de un mismo patrón), la exactitud y calidad de nuestro método analítico. Pero nunca nos podemos dormir en los laureles, las calibraciones son el paso fundamental de cualquier análisis y por lo tanto debemos realizarlas periódicamente para asegurar que no ha habido variación en la sensibilidad del equipo que nos esté dando resultados incorrectos.
¿Cada cuánto tiempo hay que realizar una calibración? Pues depende de la estabilidad del método y de las medidas de control que se realicen. Un laboratorio serio y profesional introduce continuamente (cada pocas medidas) disoluciones patrón en sus secuencias de trabajo a modo de control, si estas disoluciones arrojan resultados muy diferentes a los valores de concentración que sabemos que tienen el equipo debe ser nuevamente calibrado. De todos modos es imprescindible realizar calibrados periódicos aunque los resultados del control encajen a modo de medida de seguridad.
En el caso del trabajo con patrón externo es recomendable realizar un calibrado cada vez que se realicen 500 o 1000 medidas (valor que depende del método, la precisión y la exactitud requeridas y el comportamiento de los compuestos a analizar y las muestras). Para los métodos con patrón interno, que como hemos indicado suelen tener mayor efecto de la matriz de la muestra, es recomendable realizar calibrados con más asiduidad. Los calibrados por adición estándar se realizan sobre cada muestra, lo que hace que cada medida sea un calibrado.
Aunque calibremos el equipo correctamente, de manera profesional, de manera periódica y de forma rigurosa, ¿Cómo podemos estar seguros de no cometer errores de base al tratar nuestras muestras, tan complejas como las muestras vegetales, que reduzcan nuestra exactitud? Para ello, se diseñan estrategias de control que permiten evaluar la exactitud de los pasos de tratamiento de muestra (digestiones, encapsulados, etcétera).
El primero y más básico de ellos es la fortificación de muestras. La fortificación de muestras consiste en añadir una cantidad del compuesto a analizar a una muestra y realizar el análisis de esa muestra fortificada. El resultado obtenido, si el método está bien desarrollado, debe ser la concentración de la muestra original más, exactamente, el valor compuesto a analizar añadido. De este modo podemos certificar que: no hay pérdidas a lo largo del tratamiento de muestra que reduzcan la cantidad de analito y que no hay ningún otro compuesto en la muestra que oculte parte de la sustancia a analizar. Este procedimiento es imprescindible realizarlo a la hora de desarrollar un nuevo método de análisis o a la hora de implementarlo para un nuevo tipo de muestra.
Ilustración 5: representación de un análisis de muestra fortificada.
Otro modo para evaluar la exactitud de nuestros análisis es analizando muestras certificadas. Estas muestras son pequeñas porciones de material (un vegetal, un aceite, un extracto, etcétera) que han sido analizadas con precisión por algún laboratorio de referencia por al menos dos metodologías distintas para asegurar el resultado. Estas muestras se analizan y el resultado obtenido será más o menos exacto en tanto en cuanto se acerque al resultado de concentración entregado en un certificado por el laboratorio de referencia.
Pero, el principal instrumento para tener un correcto control de la exactitud de los resultados, de la calidad de nuestros métodos analíticos y de la precisión y profesionalidad de los técnicos que realizan las medidas son los estudios inter-laboratorio. Consisten en que varios laboratorios independientes realizan medidas de una misma muestra (normalmente se realizan al tiempo con varios tipos de muestra distintos, por ejemplo para obtener el sello “The Emerald Test” de potencia hay que realizar medidas de un aceite y de una disolución alcohólica de una mezcla de cannabinoides) con los resultados obtenidos se realiza un extenso y riguroso análisis estadístico que permite cuantificar la precisión con la que cada laboratorio trabaja.
Ilustración 6: Muestras para la realización de un inter-laboratorio de HEMPLAX.
Un laboratorio que no supere (o tan siquiera realice) estos estudios nunca puede ser un laboratorio confiable ni sus resultados pueden considerarse exactos ni precisos.
Ilustración 7: Resultados de un análisis inter-laboratorio
Por ejemplo, nosotros en Ananda Analytics Labs hemos participado y superado el “The Emerald Test” para potencia y análisis de disolventes, participamos en un inter-laboratorio liderado por la empresa holandesa “Hemp Flax” en la que obtuvimos excelentes resultados y siempre estamos abiertos a participar en este tipo de pruebas.
Ilustración 8: Sellos “The Emerald Test” que certifican la calidad en análisis de potencia (cannabinoides) y de residuos de disolventes.
Este tipo de estudios inter-laboratorio suponen una carga de trabajo alta, un conocimiento estadístico elevado y suelen ser estudios costosos. Pero son totalmente imprescindibles para evaluar y autoevaluar el trabajo en un laboratorio, identificar posibles fuentes de error y permiten conocer y hacer pública la calidad de trabajo de tu laboratorio.
Resumiendo, el control de la precisión y la exactitud de un método de análisis no solo es el principal modo de controlar la calidad de unos resultados, también es uno de los pasos más sensibles, caros y que requieren mayor profesionalidad y habilidades para cualquier laboratorio. Por eso, un laboratorio serio y responsable siempre dará información a este respecto: siempre se incluirán los márgenes de error (o intervalos de confianza) en los resultados, medirá disoluciones estándar cada pocas medidas, calibrará el equipo tan asiduamente como sea posible, fortificará muestras y participará en estudios inter-laboratorio para poder compararse con otros laboratorios. Realizando de manera periódica, profesional y precisa estos controles podemos asegurar que los resultados entregados para cualquier análisis son precisos y de calidad reduciendo las posibilidades de entregar datos erróneos con todo el gasto y problemas que puede conllevar eso.
Alberto Cantalapiedra