¿Cómo podemos calcular correctamente la potencia de nuestra marihuana? ¿Y su concentración de CBD o THC? ¿Hay algún otro cannabinoide interesante?
Se conoce como la potencia de una planta, o un preparado, de cannabis a la concentración en tanto por ciento en peso de los cannabinoides presentes. Encontrar el modo de saber la cantidad de cada uno de los muchos cannabinoides que hay presentes en una muestra de marihuana o cáñamo supone un gran reto para la química analítica. El principal problema es que estos compuestos tienen un comportamiento químico-físico muy similar; esto es debido a que poseen estructuras químicas muy parecidas ya que tienen una base parecida: un fenol (anillo de 6 átomos de carbono con grupos alcohol) con sustituyentes. Los cannabinoides presentan algunas diferencias; la principal de ellas es que algunos poseen en su estructura un grupo ácido carboxílico, lo que hace que puedan diferenciarse entre cannabinoides ácidos y neutros. El resto de la diferencia se encuentra en las variaciones en los otros sustituyentes de ese fenol. Estas diferencias suponen pequeños cambios en la polaridad de las moléculas por lo que se pueden diseñar métodos de separación basados en esto para el análisis de cannabinoides.
1: estructuras de los principales cannabinoides
El grupo de técnicas más eficaces que pueden separar los cannabinoides para medirlos son las técnicas cromatográficas. En este tipo de técnicas se introduce la muestra al inicio de un soporte, llamado fase estacionaria, formado por un material que interactúa de distinta manera con cada compuesto. Una vez las sustancias a separar están en ese soporte se hace pasar a través de él un eluyente, llamado fase móvil, que los separa dentro de este soporte.
2: esquema del funcionamiento de una técnica cromatográfica
Existen tres técnicas cromatográficas que se emplean comúnmente para el análisis de cannabinoides: cromatografía en capa fina, cromatografía de gases y cromatografía líquida.
Cromatografía de capa fina (TLC)
La primera de estas técnicas es la cromatografía de capa fina (TLC por sus siglas en inglés “Thin Layer Chromatography”). En este tipo de separación la fase estacionaria es una capa de gel de sílice o alúmina sobre un soporte metálico, plástico o de vidrio. Como fase móvil se suele emplear hexano o algún otro disolvente no polar. Este tipo de análisis de cannabinoides tiene como principal ventaja que no emplea equipos costosos y es bastante rápido. Las principales desventajas del TLC son que, aunque sirve para confirmar la presencia de algunos cannabinoides, no ofrece resultados fiables cuando pretendemos conocer la cantidad exacta de cada cannabinoide.
Cromatografía de Gases (GC)
Otra técnica de separación es la cromatografía de gases (GC por sus siglas en inglés “Gas Chromatography”). Esta técnica es la que hasta hoy ha sido la más usada y es la que recomienda la Oficina de las Naciones Unidas Contra la Droga y el Delito para ser empleada por los laboratorios oficiales en sus análisis de cannabinoides. En la cromatografía de gases la fase estacionaria se encuentra en el interior de una columna capilar (de varias decenas de metros de longitud).
3: Columna de cromatografía de gases dentro del equipo.
La fase móvil es un gas que, dependiendo del detector empleado, puede ser hidrógeno, helio o argón. Este método es fiable, robusto y reproducible y por ello es el que se emplea normalmente en el ámbito legal. El principal inconveniente de este tipo de separación es que trabaja a altas temperaturas, superiores a los 200C, por lo que corremos el riesgo de que los cannabinoides se descarboxilen y no se logre diferenciar entre formas ácidas y neutras. Para solventar este problema se puede realizar una derivación de los cannabinoides antes de ser inyectados, pero este paso implica que hay que llevar a cabo una reacción química antes de inyectar lo que aumenta sensiblemente las posibilidades de contaminación o destrucción de la muestra.
En la mayoría de las técnicas cromatográficas es necesario emplear un detector que vaya midiendo los cannabinoides después de la separación. Los dos tipos de detección más empleados en GC son el Detector de Ionización de Llama (FID por sus siglas en inglés “Flame Ionization Detector”) y el de espectrometría de masas (MS por sus siglas en inglés “Mass Spectrometry”):
· Detector FID: Es un dispositivo que va introduciendo la fase móvil en una llama de hidrógeno/oxígeno. Al ser introducidos en la llama los cannabinoides se ionizan y son detectados por la corriente eléctrica que se forma debido a esos iones. Este tipo de detección es versátil, económica y ofrece una sensibilidad razonable.
· Detector MS: En este caso los compuestos según van saliendo de la columna de separación también se ionizan (en la mayoría de los casos empleando un filamento incandescente) y se fragmentan. Estos iones se introducen en un sistema de imanes que los separan según su masa atómica. Cuando una molécula se ioniza y se fragmenta en estas condiciones produce un espectro de masas específico para cada tipo de compuesto. Por lo tanto, acudiendo a una base de datos de espectros, este detector permite identificar cada compuesto sin necesidad de introducir una disolución patrón de cada cannabinoide como con el resto de tipos de análisis. Este tipo de técnica ofrece una sensibilidad mucho mejor que con detección FID. Por otro lado estos son equipos mucho más costosos, ya que son complejos y trabajan a ultra-vacío, y también tienden a saturarse a concentraciones muy altas de cannabinoides.
4: Espectro de masas de delta-9-tetrahidrocannabinol
Cromátografía de líquidos de alta resolución (HPLC)
La última técnica analítica de la que vamos a hablar usada normalmente para el análisis de cannabinoides es la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, por sus siglas en inglés “High Performance Liquid Chromatography”). En este caso la fase estacionaria es el relleno de una columna de acero y se presenta en forma de pequeñas partículas, de un tamaño inferior al micrómetro, muy compactadas lo que ofrece una gran superficie de contacto con los compuestos que se introducen en ella.
5: Columna para HPLC
La fase móvil suele ser una mezcla de disolventes orgánicos polares que se introduce en el sistema a alta presión. El HPLC es cada vez más usada en análisis porque es una técnica tan robusta y precisa como la GC pero reduce los costes de funcionamiento. Otro beneficio es que trabaja a temperaturas cercanas a la ambiente; esto hace que se puedan identificar y separar las formas ácidas y neutras de manera rápida y precisa. Por todo esto esta técnica está imponiéndose para la separación ya que, a parte de los beneficios de la técnica en sí, los equipos HPLC suelen necesitar menos mantenimiento y son de manejo más fácil lo que reduce sensiblemente las posibilidades de cometer errores durante el análisis.
6: Cromatograma HPLC de una mezcla de cannabinoides a una concentración de 50 µg/mL.
Como sistemas de detección en esta técnica se suelen emplear detectores UV-Visible, detectores de matriz de diodos (Diode Array) o espectrometría de masas:
· Detector de espectrometría de masas: este detector es equivalente al empleado en GC. En este caso hay un problema ya que el detector MS trabaja en condiciones de ultra-vacío y el HPLC a altas presiones. Por lo tanto estos equipos deben tener un sistema entre la separación y el detector que permita a los dos sistemas trabajar. Esto es un gran problema técnico que normalmente multiplica el coste tanto del equipo como de su funcionamiento.
· Detector UV-Visible: estos detectores constan de una lámpara, un sistema de selección de longitud de onda, una celda por la que pasa la fase móvil y un detector. Funcionan seleccionando la longitud de onda a la que absorben luz los cannabinoides y midiendo la cantidad de luz absorbida al pasar. Este es el primer sistema de detección que se empleó para el HPLC y da problemas cuando hay sustancias que provoquen interferencias a esa longitud de onda en la muestra.
· Detector Diode Array: este detector es la versión moderna y mejorada del anterior. También consta de un sistema de lámparas, una celda por la que pasa la fase móvil y un detector. La principal diferencia se encuentra en que el detector es una matriz de sensores. Este detector trabaja en todas las longitudes de onda a la vez por lo que obtenemos un espectro completo en cada momento. Esto permite identificar los cannabinoides que van pasando por el detector ya que cada compuesto posee un espectro definido. Al tener el espectro completo podemos seleccionar la longitud de onda de medida dependiendo de las condiciones por lo que reducimos el efecto de las interferencias. También, medir a una longitud de onda distinta facilita trabajar a concentraciones de cannabinoides mayores (usando señales no saturadas) lo cual es muy útil para ver cannabinoides mayoritarios y minoritarios sin tener que realizar dos análisis.
Conclusión
Tenemos tres técnicas cromatográficas de separación y análisis de cannabinoides. Dependiendo de las necesidades de cada momento, cualquiera de estos tipos de cromatografía pueden servirnos. El análisis TLC es algo inexacto y primitivo, pero proporciona resultados muy rápidos y no requiere casi inversión, por lo que es perfecto sí no nos interesa la concentración exacta y sólo queremos conocer sí hay o no cannabinoides. La cromatografía de gases da buenos resultados si no deseamos diferenciar entre formas ácidas y neutras. La cromatografía HPLC es un método que da excelentes resultados, es robusto, no requiere un mantenimiento complicado y permite diferenciar entre formas ácidas y neutras. Por otro lado, si incluimos un detector de masas podemos identificar cannabinoides poco comunes en nuestra muestra sin necesidad de patrones y, en último lugar, el detector “Diode Array” (como usamos en Ananda Lab) permite trabajar en presencia de interferencias y en un intervalo de concentraciones de entre 0.01 y varios cientos de microgramos por mililitro.
Alberto Cantalapiedra